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          凍存細胞復蘇操作說明

          發布日期:2018-05-31瀏覽次數: 信息來源: 廣州市雷德生物科技有限公司

          (一)適用范圍

          本操作說明適用于PBMC、CD3、CD4、CD8、CD19、NK等凍存細胞的復蘇操作過程。

          (二)主要試劑

          復蘇培養基:含有20%滅活FBS的RPMI-1640培養基,復蘇1管細胞用量為30mL。

          注:10%-20%滅活FBS均可,推薦20%滅活FBS。

          IMDM,DMEM,MEM培養基均可,推薦RPMI-1640培養基。

          (三)儀器設備

          恒溫水浴鍋、生物安全柜(超凈工作臺)、離心機。

          注:如無恒溫水浴鍋,用溫度37±3℃溫水亦可。

          (四)復蘇操作流程

          打開恒溫水浴鍋,水溫設置為37℃。

          將復蘇培養基孵育至37℃,在生物安全柜內,取9 mL復蘇培養基15 mL離心管。

          從液氮罐或超低溫冰箱取出凍存管,用鉗子夾住凍存管蓋子邊緣,迅速放入37°C水浴中均勻快速的水平搖晃(勿將管蓋浸入水中),直至凍存管中冰晶完全融解,停止水?。s90s-120s,確定完全融解后再進行轉移)。

          用75%酒精擦拭凍存管表面以及蓋子,在生物安全柜內打開凍存管,并把凍存管內溶液用移液器轉移到裝有9 mL復蘇培養基的15 mL離心管內(轉移時吸取和打出液體要輕柔緩慢,15s均勻吸取/打出1mL細胞懸液)。

          吸取1 mL復蘇培養基洗滌凍存管,再將洗滌液轉移到15 mL離心管內,按以上步驟重復洗滌凍存管一次。輕輕吹打5-7次混勻細胞,離心(20℃,400×g,10 min,accel/brake均為9)。

          離心后,棄上清,加入復蘇培養基至10mL,輕輕吹打重懸細胞,離心(20℃,400×g,10 min,accel/brake均為9)。

          離心后,棄上清,吸去殘留液體,加入復蘇培養基(根據計數需要計算加入復蘇培養基的體積,如用血球計數板進行計數,推薦重懸濃度5-10M/mL),輕輕吹打重懸細胞,避免氣泡。

          對重懸均勻的細胞懸液進行數量和活率測定。

          (五)復蘇注意事項

          為避免細胞損失太大,復蘇過程盡可能使用15mL離心管。

          如果儲存凍存細胞的設備距離水浴較遠,應用干冰進行轉移,避免凍存細胞在室溫中暴露太久。

          融解搖晃過程中,不可將凍存管管蓋浸入水中,以免水進入管中,造成污染。

          浴后不可顛倒或傾斜凍存管,以免造成細胞損失。

          細胞水浴過程操作要穩定快速,轉移細胞到離心管以及吹打時操作要輕柔緩慢,切勿快速吹打剛剛復蘇的細胞。

          減少棄上清后的液體殘留,以保證計數的準確性,但去上清時不可吸到管底細胞。

          復蘇后細胞會在一個小時左右恢復到最佳狀態,如需對細胞進行損傷性處理,請等待細胞活性達到最佳后進行。

          如需將細胞放置較長時間才能進行實驗,則加入復蘇培養基至10mL,37℃培養箱內靜置或搖床上震蕩。

          應按本說明進行復蘇操作,且復蘇操作過程不能有時間停頓,以保證細胞活性。

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